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Biochimica, biologia e fisica.

sono previsti 4 ETCS (36 ore) di lezioni teoriche, e 2 ETCS (18 ore) di attività di laboratorio computazionale.

Padronanza dei principi di enzimologia strutturale intesa come strumenti di studio strutturale degli enzimi per le applicazioni biotecnologiche.

Comprensione della struttura tridimensionale degli enzimi per migliorarne le prestazioni

Capacità di individuare e consigliare le correte procedure nelle varie fasi del processo di studio della struttura degli enzimi; capacità di trasferire in modo chiaro ed esauriente informazioni, idee e soluzioni tecniche a interlocutori di vario tipo.

(0.25 ETCS) Introduzione: Organizzazione del corso. Introduzione agli argomenti del programma. Introduzione alla biochimica strutturale, con particolare riferimento ai suoi strumenti, obiettivi e potenzialità nell’ambito dell’enzimologia.

Metodi di analisi strutturale ai raggi X.

Cristallizzazione di macromolecole biologiche (0.25 ETCS): Principi basilari, stadi e meccanismi del processo di cristallizzazione con particolare riferimento ai cristalli di macromolecole biologiche. Proprietà e crescita dei cristalli proteici. Principali tecniche per la cristallizzazione di macromolecole biologiche.
Basi fisiche della diffrazione di raggi X e celle elementare di un cristallo (0.5 ETCS): Caratteristiche dei raggi X, sorgenti convenzionali e luce di sincrotrone, tecniche di raccolta delle intensità di diffrazione da cristalli proteici. Principi geometrici della diffrazione e legge di Bragg. Simmetria nei cristalli ed operazioni di simmetria consentite per molecole chirali. La cella elementare e gli indici dei piani reticolari in un cristallo, posizioni ed intensità dei riflessi, risoluzione dei dati.

Problema della fase in cristallografia e metodi di risoluzione strutturale di proteine (0.75 ETCS). Il fattore di struttura come somma di Fourier; trasformata di Fourier per ottenere la densità elettronica della molecola in esame. Introduzione al problema della fase e metodi per la determinazione della fase: sostituzione molecolare (Molecular Replacement), sostituzione isomorfa (SIR e MIR), scattering anomalo (SAD e MAD, SIRAS e MIRAS). Miglioramento delle fasi e affinamento del modello.

(1.5 ETCS) Metodi di analisi strutturale con Microscopia elettronica. Microscopio elettronico. Preparazione del campione. Principi di imaging, raccolta dei dati, ricostruzione della densita elettronica di una macromolecola. Metodo di risoluzione di una struttura EM.
The resolution revolution: recenti cruciali progressi nella microscopia crioelettronica (Cryo-EM). Confronto tra cristallografia a raggi-x e Cryo-EM. Interazione degli elettroni con la materia: principi della diffusione e diffrazione degli elettroni; schema base di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM).

Formazione dell’immagine per contrasto di ampiezza o di fase: TEM di campioni biologici; projection assumption (PA) e approssimazione a weak-phase-object (WPOA) per diffusori deboli di elettroni; uso della sfocatura e delle aberrazioni delle lenti per aumentare il contrasto. Trasformata di Fourier e formazione dell’immagine nel TEM: point spread function (PSF) e contrast transfer function (CTF); particle analysis; preparazione dei campioni.
Dalle immagini in 2D alla struttura in 3D: ricostruzione delle immagini; concetto di risoluzione in cristallografia e in microscopia crioelettronica. Costruzione e affinamento del modello in cristallografia e microscopia crioelettronica: principi e aspetti pratici.

(2 ETCS) Affinamenti di una struttura cristallografica o da cryo-EM. Prova pratica con inserti teorici di risoluzione e affinamento di una struttura cristallografica con validazione di una struttura cristallografica o di cryo-EM. Il corso prevede una parte di esercitazione in laboratorio: esame dei cristalli ottenuti al microscopio per valutarne la qualità e scelta dei campioni adatti all’indagine a RX. Esercitazione con uso di software Coot adeguato per miglioramento e affinamento del modello cristallografico e/o di microscopia elettronica.
Validazione della struttura cristallografica e deposito nella banca dati Protein Data Bank.

(0.75 ETCS) Casi studio. B-galactosidasi (EM), DRUG Design (MX), Lipasi (MX). Esempi di ottenimento della struttura 3D di proteine. Guida alla lettura di articoli di dinamica e struttura proteica.

Elaborato scritto di tre domande sul programma del corso. Tempo = 1 ora

L’elaborato scritto verrà valutato per attinenza alla tematica, completezza, correttezza, uso appropriato della terminologia.

La prova avrà punteggio positivo quando lo studente dimostrerà una conoscenza complessiva degli argomenti, con un'esposizione competente. La profonda conoscenza degli argomenti porterà al massimo dei voti.

Ad ogni domanda vengono assegnati 10 punti. la lode sarà assegnata su risposta eccezionale alle tre risposte. Il voto finale è dato in trentesimi. Il superamento dell'esame comporterà il conseguimento di voti che vanno da un minimo di 18 a un massimo di 30 e lode.

David Blow “outline of Crystallography for Biologists”, 1st ed., Oxford University Press
Grant Jensen, "Getting Started in Cryo-EM", http://cryo-em-course.caltech.edu. Dispense di lezione messe a disposizione sul sito Learn dell'insegnamento.

Si. Collegamento su Learn.univpm.it